جداسازی و کشت سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان

مواد و وسائل مورد نیاز
روپوش دستکش- ماسک- دسته اسکالپل-تیغ جراحی استریل- قیچی- پنس- تامپون-الکل 70%- PBS -لوله فالکون 15ml–راک-سرنگ 5ml با نیدل 22 یا 23 -لیوان حاوی پودر یخ- سینی تشریح- سطل زباله- کیسه زباله- پتری دیش- محیط DMEM –FBS – فلاسک کشت - حیوان آزمایشگاهی رات نژاد ویستار

محیط سازی
 محیط DMEM حاوی FBS10% - پنی سیلین،استر پتومایسین 1% و L-Glutamine 1%
 (در صورتی که محیط DMEM  حاوی  L-Glutamine  باشد نیازی به اضافه کردن آن نیست)
برای مثال جهت تهیه ml 50  محیط DMEM به روش زیر عمل می کنیم

DMEM ..... 44 ml
FBS  ....5 ml
Pen/Strep ...0.5 ml
L-Glut... 0.5 ml


جداسازی استخوانهای ران و درشت نی

پس از آرام کشی حیوان با گاز CO2  حیوان به روی سینی منتقل می گرددو پس از الکل پاشی پاها و محوطه شکمی و تمیز کردن موضع، جدا کردن پوست و عضلات پا ، جدا کردن اتصالات تاندونی و لیگامنتی مفصل ران صورت می گیرد.
در این مرحله ناحیه شکمی و پاهای حیوان با الکل 70% آغشته شده و پوست پاها کاملا جدا می گردد.
با احتیاط بافت و ماهیچه های اطراف ران و درشت نی را جدا نموده به گونه ای که استخوانها نمایان گردند.
به آرامی اتصال قسمت پایین استخوان درشت نی به کف پاها و اتصال بالای استخوان ران به لگن را جدا کرده به گونه ای که هیچ گونه آسیبی به استخوان های ران و درشت نی وارد نگردد.
سایر مراحل به شرح ذیل است:
* انتقال پا به داخل پتری دیش
*جدا کردن عضلات باقیمانده
*جدا کردن مفصل زانو
*جدا کردن عضلات و فشیای باقیمانده از روی استخوان های ران و درشت نی
*انتقال استخوانهای ران و درشت نی به داخل فالکون ml15 حاوی PBS که داخل لیوان یخ قرار دارد.
*تکرار مراحل فوق برای پای دیگر
*انتقال لاشه موش به داخل کیسه مخصوص و سپس به داخل سطل زرد رنگ
*تمیز کردن وسائل
*انتقال فالکون حاوی نمونه به آزمایشگاه


 استخراج مغز استخوان

*انتقال نمونه به زیر هود
*خارج کردن استخوان از فالکون
*شستشو با اسپری الکل
*انتقال به داخل پتری دیش
*قطع دو انتهای استخوان از محل اپی فیز به کمک قیچی یا بن کاتر
*پر کردن سرنگ از محیط کشت حاوی DMEM & Pen/Strep  بدون FBS
*قرار دادن استخوان به کمک پنس در بالای فالکون
*شستشوی ( flushing) مغز استخوان با سرنگ حاوی محیط : نیدل سرنگ را از یک سر استخوان فرو و به آرامی کمی از محلول را خالی می کنیم تا محتویات استخوان درون فالکون تخلیه گردد.این فرایند را از هر دو سر استخوان چندین بار تکرار می کنیم تا رنگ قرمز استخوان به سفید تغییر یابد.
*تکرار اعمال فوق برای استخوان دیگر و تکرار برای استخوانهای پای دیگر
.

جدا سازی سلولهای مغز استخوان

*سانتریفیوژ محتویات فالکون  با دور rpm1200 در دمای 20 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه
*دورریختن مایع رویی فالکون پس از اتمام سانتریفیوژ
*افزودن 1 میلی لیتر محیط کشت تازه به رسوب حاصل در فالکون
*ایجاد سوسپانسیون سلولی  با پیپتاژ محتویات درون آن


 کشت سلول

*انتقال سوسپانسیون سلولی به داخل فلاسک  cm225
*افزودن 5 میلی لیترمحیط کشت تازه به داخل فلاسک
*مشاهده سلولها زیر میکروسکوپ ( شفاف و کروی شکل دیده می شوند)
*انتقال به داخل انکوباتور (CO2 5%،دمای  °37 ورطوبت 85%)
*تعویض محیط در روز بعد و سپس هر سه روز یکبار تا سلولهای غیر مزانشیمی کنده شده و از محیط خارج شوند و سلول های بنیادی مزانشیمی تقریباً خالص با تراکم 80%-70% باقی بمانند
"در این مرحله سلول ها از حالت کروی به دوکی تغییر شکل می دهند."
  برای تعویض محیط کشت محتویات داخل فلاسک تخلیه شده ، کف فلاسک با 2 میلی لیتر PBS شستشو داده شده و 5 میلی لیتر محیط جدید به فلاسک اضافه می گردد
.

پاساژ سلولی

پس از پوشیده شدن کف فلاسک به وسیله سلولهای مغز استخوان و دستیابی به  Confluency  یا تراکم سلولی حدود 80%- 70% ، در کشت اولیه primary culture  پاساژ به قرار زیر صورت میگیرد:
*تخلیه محیط کشت موجود در هر فلاسک
*شستشوی سطح سلولها با حدود 3 میلی بافر فسفاته سالین PBS
* افزودن حدود 2 میلی لیتر Trypsin/EDTA به هر فلاسک 25 cm 2
*انتقال فلاسک به داخل انکوباتور برای افزایش عملکرد Trypsin/EDTA به مدت 3 دقیقه
*ایراد ضربات آرام به فلاسک برای راحت تر جدا شدن سلولها از کف فلاسک
*خنثی سازی اثر ترپسین با افزودن محیط کشت حاوی FBS 10% به میزان 2 میلی لیتر به هر فلاسک
*پیپتاژو ایجاد سوسپانسیون سلولی
*انتقال سوسپانسیون حاصله به داخل فالکون 15 میلی لیتری
*سانتریفیوژ در دور rpm1200 در دمای  °20 به مدت 5 دقیقه
*دور ریختن مایع فوقانی
*افزودن محیط کشت سلولی  حاوی FBS 10% به میزان 1 میلی لیتر به رسوب حاصل
*پیپتاژو ایجاد سوسپانسیون سلولی
*انتقال سوسپانسیون حاصله به دویا سه فلاسک جدید 25 cm 2  بر حسب میزان تراکم سلولی
*افزودن 4  میلی لیتر محیط کشت سلولی حاوی FBS 10% به  هر فلاسک
*انتقال فلاسک های جدید به داخل انکوباتور
*تعویض محیط هر 3 روز یکبار تا دستیابی به تراکم مجدد 80-70% سلولی
.


ذخیره سازی سلولهای بنیادی مزانشیمی به صورت منجمد

*خارج کردن فلاسک کشت سلولی با تراکم سلولی 80%-70% از انکوباتور
*تخلیه محیط کشت
*شستشوی سلول ها با PBS
*افزودن 2 میلی لیتر Trypsin/EDTA
*انتقال به انکوباتور به مدت 3 دقیقه
*خارج نمودن فلاسک از انکوباتور به همراه ایراد ضربات ملایم به فلاسک
*افزودن 2 میلی لیترمحیط کشت سلولی
*پیپتاژ و ایجاد سوسپانسیون سلولی
*انتقال سوسپانسیون سلولی به داخل فالکون
*سانتریفیوژ در دور rpm 1200 در دمای °20  به مدت 5 دقیقه
*دور ریختن مایع فوقانی
*افزودن 1 میلی لیتر محیط انجماد به رسوب حاصل 50%FBS-DMSO10%-40%DMEM
به ازای هر 1 x 106  سلول ، 1 میلی لیتر محیط انجماد استفاده می کنیم.
*پیپتاژ و ایجاد سوسپانسیون
*انتقال لوله فریزر(cryovial=cryotube) به داخل فریزر 20- به مدت 2  ساعت
*انتقال لوله فریزر به داخل فریزر 80- برای یک overnight
انتقال لوله فریزر به داخل تانک ازت


روش ذوب کردن سلولهای انجماد یافته

*خارج کردن لوله فریزر حاوی سلول از تانک ازت
*قراردادن لوله ها در بن ماری  °37 و ذوب آرام محلول داخلی
*فراهم آوردن فالکون محتوی 3 میلی لیتر محیط کشت معمول سلول به ازای هر 1 میلی لیتر محیط انجماد
*انتقال هر یک میلی لیترمحلول سلولها به یک فالکون 15 میلی لیتری
*پیپتاژ و ایجاد سوسپانسوین سلولی
*سانتریفیوژ در دور 1200rpmدر دمای 20 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه جهت حذف DMSO
*دور ریختن محلول فوقانی
*افزودن 1 میلی لیتر محیط کشت معمول سلولی به رسوب حاصله
*پیپتاژ و ایجاد سوسپانسیون
*انتقال محلول سلولی به داخل فلاسک25   
*افزودن 5 میلی لیتر محیط کشت معمول سلولی
*توزیع  آرام محیط در تمام نفاط کف فلاسک
*انتقال به داخل انکوباتور
*تعویض محیط هر 3 روز یکبار تا تراکم سلولی 80-70%
.

 

 
مرکز تحقیقات فناوری سلول های بنیادی
دانشگاه علوم پزشكی شيراز
شيراز، خيابان خليلي ، برج پژوهشي محمد رسول الله
تلفكس: 07136281547
 پست الكترونيك: 
sctrc@sums.ac.ir