محیط كشت
محیطی استریل سرشار از مواد غذایی و اكسیژن دارای اسدیته و حرارت مناسب كه مقدار متعادلی از نمك های مختلف را داشته باشد.
       محیط پایه+سیستم بافری+سرم+آنتی بیوتیك

محیط پایه

ابتدایی ترین آنها محلول های نمكی متعادل شده مثل بافر فسفات است.
فاقد بیكربنات بوده و به تغییرات پی اچ حساس است. :DPBS
EBSS
HBSS
در واقع این محلول ها یون های ضروری حیات را دارا هستند.مثل كلسیم منیزیم پتاسیم فسفات و سدیم
امروزه هورمون ها ، ویتامین ها ، اسید های آمینه ، اسید های چرب و لیپید های مختلف به محیط ها پایه فوق اضافه شده و محلول های غنی تری تهیه شده است.
MEM-DMEM-GMEM-RPMI 1640-IMDM-Hams F10 , F12-DEM/F12
 در نهایت باید گفت كه یك محیط كشت پایه شامل :1-نمك های معدنی2-كربوهیدراتها3-اسیدهای آمینه4-ویتامین ها5-اسید های چرب و لیپیدها6-پروتئین ها و پپتید ها است.

نمك های معدنی
این نمك ها با ایجاد یك محلول ایزوتونیك تعادل اسمزی داخل و خارج سلول را ایجاد می كنند.
با تامین یون های سدیم ، پتاسیم و كلسیم ، پتانسیل غشا را تنظیم می كنند.
با تامین یون های فوق به عنوان كوفاكتور آنزیم های مختلف در چسبدین سلول ها به ماتریكس سلولی نقش دارند.
محیط های DMEM-MEM حاوی یون های منیزیم و كلسیم بیشتری نسبت به RPMI است و برای رشد سلول های چسبیده مناسب تر است. بر خلاف محیط RPMI كه برای رشد سلول های شناور نظیر لنفوتئیدی مناسب تر است.

ویتامین ها
پیش ساز بسیاری از كوفاكتور های آنزیمی بوده و بسیاری از آنها به خصوص ویتامین های گروه بی برای رشد و تكثیر سلول ها ضروری هستند.
 
 سیستم بافری
اسیدیته مناسب اغلب سلول ها :7.4-7.2
اسیدیته مناسب فیبروبلاست ها :7.7-7.4
اسیدیته مناسب سلول های دگرگون شده ای كه به صورت پیوسته درآمده اند :7.4-7.0
الف ) سیستم بافری طبیعی : در اثر انحلال گاز دی اكسید كربن در محیط كشت و ایجاد تعادل شیمیایی بین یون كربنات و بی كربنات ایجاد می گردد.
یون بی كربنات در تنظیم اسمولالیته محیط نیز نقش دارد.
این روش روش مقرون به صرفه و ساده ای است.
در واقع در اثر متابولیسم سلولی یون +H تولید می شود.یون بی كربنات با این یون تركیب شده و ضمن تولید اسید كربنیك به مولكول آب و دی اكسید كربن تبدیل شده ، از تغییر اسیدیته محیط جلوگیری می كند.
CO3    HCO3
ب ) سیستم بافری شیمیایی : توسط تركیبات زویترونی مثل  HEPES یا MOPS ایجاد می گردد.
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
MOPS 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid
تركیبات فوق گرانقیمت هستند و برای برخی از سلول ها سمی
هپس در غلظت 25 میلی مولار و ماپس در غلظت 20 میلی مولار استفاده می شود.
 
افزودن پیروات با غلظت 1 الی 5 میلی مولار باعث افزایش تولید دی اكسید كربن اندوژن توسط سلول ها و كاهش نیاز به دی اكسید كربن اگزوژن می گردد.
(C3O3H3)-
محیط L15 حاوی پیروات است.
Leibovitz’s L-15
برخی از سلول ها دی اكسید كربن اندوژن زیادی تولید می كنند. برای كنترل اسیدیته به محیط آنها هپس اضافه می گردد.
میزان تراكم سلول ها بر میزان نیاز به دی اكسید كربن موثر است.
لذا نشانگر فنل موجود در محیط باعث می شود تا ما قدرت تشخیص اسیدیته محیط را برای واكنش ها ی بهتر  داشته باشیم
.



رنگ
PH
ارغوانی
7.7
قرمز مايل به آبی
7.6
قرمز
7.4
نارنجی
7
زرد
6.5
 

زرد شدن محیط كشت : در اثر : بالا بودن غلظت دی اكسید كربن یا رشد بیش از حد سلول ها یا آلودگی میكروبی
ارغوانی شدن محیط كشت : در اثر : كم بودن غلظت دی اكسید كربن یا محكم بستن در فلاسك های بدون فیلتر
 
سرم

مخلوط پیچیده ای از پروتئین ها ، ویتامین ها و عوامل رشد مانند سرم جنین گاوی ، سرم گوساله تازه متولد شده ، سرم اسب است كه با غلظت 2 الی 20 درصد استفاده می گردد.در تنظیم سیستم بافری نقش به سزایی دارد.
سرم جنین گاوی معروفترین آنها ، غنی بوده و سرشار از عوامل رشد است.ضمنا ایمونوگلوبین كمتری نسبت به سایر سرم ها دارد.
سرم سلول ها را از آسیب فیزیكی محافظت می كند.این آسیب ها در محیط های كشتی كه دائما هم زده می شوند و یا هنگام كندن سلول ها از كف ظرف به سلول ها وارد می گردد.
سرم ها قدرت چسبندگی به سموم و ختنثی سازی آنها را دارند.
مهمترین نكته استفاده از سرم تهیه آن از شركت های معتبر برای جلوگیری از آلودگی است .عمده ترین آلودگی ها وجود مایكوپلاسما و ویروس گاوی مولد اسهال ویروسی و عامل مولد جنون گاوی یا آنسفالوپاتی اسفنجی شكل گاوی است.
برای از بین بردن كمپلمان سرم به منظور كاهش خطرات آلودگی های ویروسی ، سرم خریداری شده را به مدت نیم ساعت در بن ماری 56 درجه قرار میدهند.
افزودن 10 درصد سرم به محیط كشت در نهایت باعث افزوده شدن 4.8 میلی گرم پروتئین اضافی در هر میلی لیتر محیط كشت می شود و استخراج و فرآوری محصول اصلی و نهایی را مشكل می كند.
ضمنا استفاده از سرم هزینه بر است.
 
آنتی بیوتیك ها

رایجترین آنها
 100 واحد در میلی لیتر پنی سیلین برای جلوگیری از رشد باكتری های گرم مثبت و 100 میكروگرم در لیتر استرپتومایسین برای جلوگیری از رشد باكتری های گرم منفی
50میكروگرم در میلی لیتر جنتا مایسین برای جلوگیری از رشد باكتری های گرم مثبت و منفی و مایكوپلاسماها
كانامایسین
داروی ضد قارچ آمفوتریسین بی
 
محیط های كشت اغلب به سه صورت پودری ، محلول آماده به مصرف و محلول با غلظت 10 برابر عرضه می گردد.

در صورت تهیه محیط كشت از پودر های آماده می بایست از آب مقر دیونایز شده ای كه با روش اسمز معكوس و با استفاده از ستون رزینی مناسب تهیه شده است و به كمك اتوكلاو استریل گردیده برای محلول سازی استفاده كرد و بلافاصله محلول را از فلیتر 0.22 میكرون عبور داد.با این روش اكثر میكروارگانسیم ها حذف می شوند اما ویروس ها و بعضی از مایكوپلاسماها می توانند از فیلتر های مذبور عبور كنند.

بهتر است محیط كشت حداكثر برای دو هفته تهیه شود تا فعالیت تركیبات آن تا پایان مصرف حفظ شود و در صورت آلودگی فقط مقدار محدودی از آن آلوده گردد.

 
مرکز تحقیقات فناوری سلول های بنیادی
دانشگاه علوم پزشكی شيراز
شيراز، خيابان خليلي ، برج پژوهشي محمد رسول الله
تلفكس: 07136281547
 پست الكترونيك: 
sctrc@sums.ac.ir