ویژگی های آزمایشگاه كشت سلولی

دوری از بخش های میكروب شناسی و محل نگهداری حیوانات
دوری از مكان های پر تردد
استفاده از میز ها و كابینت های استیل تا به راحتی ضد عفونی شوند.
برخورداری از قسمت قرنطینه برای بررسی مواد تازه وارد
برخورداری از ناحیه اصلی كه عاری از عوامل عفونی و مواد مشكوك است.
وجود هوای فشار مثبت در آزمایشگاه نسبت به راهرو ها
برخورداری از سیستم تثبیت كننده برق شهر
برخورداری از كف و دیواره های صاف و صیقلی و ضد آب با رنگی روشن
بسته بودن همیشگی درب آزمایشگاه
نظافت هفتگی كف آزمایشگاه با دترجنت و میز ها با الكل 70%

 

دستور العمل كار در اتاق كشت سلولی

1-نظافت و تمیزی هفتگی كف آزمایشگاه با دترجنت
2-بسته بودن درب اتاق
3-عدم وجود وسایل غیر ضروری
4-چك كردن فیلتر های هود لمینار در فواصل زمانی مناسب
5-پاك كردن سطوح میز ها به صورت هفتگی با یك ماده ضد عفونی كننده مناسب مثل الكل 70%
6-الكل كشی تمام سطح هود قبل و پس از كار كشت
7-تعویض هفتگی آب انكوباتور
8-تمیز نمودن سطوح داخلی انكوباتور با دترجنت و الكل 70 درصد به صورت ماهیانه
9-اتوكلاو ظروف شیشه ای قبل از استفاده
10-قراردادن ظروف شیشه ای بدون در پوش در فور به مدت 90 دقیقه و در دمای 160 درجه سانتی گراد با درپوشی از فویل قبل از استفاده

 
 
 

تجهیزات موجود در آزمایشگاه

1-هود لمینار
2-انكوباتور
3-میكروسكوپ اینورت
4-میكروسكوپ معمولی
5-میكروسكوپ فلورسنت
6-میكروسكوپ
7-سانتریفیوژ
8-یخچال
9-فریزر 4-
10-فریزر 70-
11-تانك ازت
12-اتوكلاو
13-فور
14-شیكر انكوباتور
15-بن ماری
16-ترازوی دیجیتال
17-روتاتور
18-سمپلر ثابت و متغیر و شارژر سمپلر ها
19-فلاسك های كشت < پیپت ها < پلیت ها < سر سمپلر < لوله های فالكون < ویال های فریز
20-لام نئوبار و لامل

 
 
 
 
 

هود لمینار

دارای فیلتر های هپا بوده و قادر به جذب ذرات بزرگتر از 0.3 میكرو متر است و با تزریق هوای استریل به فضای كاراز آلودگی محیط كشت توسط باكتری ها و ذرات معلق در هوا جلوگیری نموده از اپراتور ها در برابر آئروسل های ایجاد شده محافظت می نماید.
HEPA : high efficiency particular air
دارای لامپ ماورائبنفش می باشند كه روشن نمودن آ نقبل و بعد از كار فضای كار را استریل می نماید.
هود های كلاس 1 دارای جریان هوای افقی بوده و فقط برای كارهای بافت شناسی ، جنین شناسی استفاده شده و جداسازی سلول از نمونه های اخذ شده از بدن جانداران در زیر این هود ها انجام می گیرد.
هود های كلاس 2 دارای جریان عمودی بوده برای كشت، پاساژ، فریز و كلیه امور مربوط به ظروف حاوی سلول ها زیر این هود انجام میگیرد.
10 الی 15 دقیقه قبل از كار هود را روشن نمایید.
هنگام كار درب هود بسته نباشد.این كار باعث آسیب پمپها میی شود.
قبل و بعد از كار تمام سطح هود را با گاز و الكل 70 % تمییز كنید.
از پاشیدن الكل به فیلتر ها خودداری نمایید.

 
انكوباتور
این دستگاه شرایط بهینه لازم برای رشد سلول ها نظیر دما ، رطوبت و سطح مناسبی از دی اكسید كربن را فراهم می آورد.
در تكنیك های كشت سلولی پستانداران و حیوانات خونگرم شرایط زیر مطلوب است:
T:37c                    humidity: 70-80%                   co2:5%
اغلب محیط كشت های مجود دارای بی كربنات سدیم هستند كه به كمك دی اكسید كربن موجود در انكوباتور سیستم بافری مناسبی برای تنظیم PH فراهم می آورند.
ارغوانی شدن محیط كشت بودن سلول نشانه كم بودن دی اكسید كربن و و زرد شدن آن نشانه زیاد بودن دی اكسید كربن است.
رطوبت انكوبار از آب مقطر استریلی كه درسینی استیل مخصوص داخل آن ریخته شده است فراهم می گردد.
رطوبت موجو فضا را برای رشد باكتری ها و قارچ ها فراهم می آورد.لذا ظرف آب بایستی به صورت هفتگی با اتانول 70 درصد استریل و آب تازه به آن وارد شود.ضمنا از سولفات مس 1% یا روكال 2% نیز در این آب برای جلوگیری از رشد قارچ ها استفاده می شود.


سانتریفیو‍‍ژ
همواره زمان و سرعت سانتریفیوژ را مطابق با پروتكل موجود تنظیم كنید.سرعت و زمان زیاد باعث به هم چسبیدن سلول ها و آسیب سلولی می گردد.
پس از سانتریفیوژ‍ سریعا مایع رویی خارج و رسوب سلولی را به صورت سوسپانسیون درآورید.
سنتریفیوژ طولانی را در سانتریفیوژ های یخچال دار انجام دهید تا دمای نمونه ها در اثر ازدیاد دمای موتور بالا نرود.سایر سانتریفیوژ ها در دمای محیط صورت میگیرد.
به هنگام سانتریفیوژ در نمونه ها كاملا بسته باشد.تولید جریان شدید هوا امكان ورود آئروسل ها ی موجود در فراهم می آورد.
لوله های آزمایش به صورت متوازن و روبروی هم قرار گیرند.عدم توازن باعث شكسته شدن لوله ها و آسیب به موتور دستگاه می گردد.
ترمز ناگهانی دستگاه باعث جداشدن سلول ها از ته لوله و گاهی ازدست رفتن سلول های با ارزش می شود.
این دستگاه به صورت هفتگی با اتانول 70 درصد استریل می گردد.


میكروسكوپ
سلول های كشت داده شده هر روز باید از نظر میزان رشد ، مورفولوژی سلول و احتمال آلودگی با باكتری ها و قارچ ها با میكروسكوپ معكوس بررسی شوند.
برای شمارش سلولی و تعیین حیات سلول وجود یك میكروسكوپ نوری مجهز به فاز كنتراست لازم است.
میكروسكوپ ایمون فلورسانس جهت بررسی لام های رنگ آمیزی شده با رنگ هوخست برای بررسی آلودگی مایكوپلاسمایی است
.


 

سيستم های خنك كننده

 

 

 

محيط كشت و بافر ها

4°C

يخچال

سرم ها ، آنزيم ها و اسيد های آمينه غير ضروری، گلوتامين ، پيروات ، آنتی بيوتيك ها

20°C-

فريزر

انجماد اوليه سلول ها

70°C-

فريزر

نگهداری سلول ها برای مدت زمان طولانی

196°C

تانك ازت


سيستم های استريليزاسيون

برای استريليزاسيون مرطوب بعضی از بافر ها ، ظروف شيشه ای در پيچ دار ، سر سمپلر ها از اتوكلاو استفاده می شود.

هنگام اتوكلاو كردن ظروف شيشه ای در آنها يك دور باز گذاشته می شود تا تبادل بخار آب امكان پذير شده و فشار هوای داخل و خارج بطری برابر گردد.

پس از اتوكلاو بايستی فورا در ظرف را بست.

عموما اين كار در دمای 121 درجه سانتی گراد و فشار 15 پوند بر اينچ مربع و مدت زمان 15 الی 20 دقيقه صورت می گيرد.

درصورت لزوم برخی از وسايل پلاستيكی را به مدت نيم ساعت در اتانول 70 درصد قرار داده و به كمك هوای هود لمينار و نور ماورادبنفش خشك می كنند تا استريل گردد..

محيط ها كشت ، آنزيم ها ، هورمون ها ، فاكتور های رشد و بی كربنات ها قابل اتوكلاو نيستند و بايستی توسط سيستم فيلتراسيون اتوكلاو شوند.           


ظروف كشت

سلول ها را می توان در ظروفی نظير فلاسك های تی شكل ، پليت های 4،6،24،48،96 خانه يا پتری ديش ها كشت داد.

برای تكثير در مقياس معمولی از فلاسك تی شكل و از پليت های 96 خانه برای كلون كردن استفاده می گردد.

 

مواد ضد عفونی كننده و دفع فضولات و زباله های آزمايشگاهی

 

 

سطوح كار

هيپوكلريت ها مثل آب كلره يا آب ژاول    1000 ppm

پس ماند های كشت به مدت يك شب در اين محلول نگهداری می گردد و با آب فراوان دفع می شود.

هيپوكلريت ها مثل آب كلره يا آب ژاول    1000 ppm

يا قطرات پاشيده شده از محيط كشت

هيپوكلريت ها مثل آب كلره يا آب ژاول    2500 ppm

سر سمپلر ها و پيپت ها به مدت يك شب در اين محلول نگهداری شده سپس اتوكلاو گرديده و دور ريخته می شود.

به جای اتوكلاو می توان آنها را در كوره های مخصوص سوزاند.

هيپوكلريت ها مثل آب كلره يا آب ژاول    2500 ppm

 

 

از آنها برای ضدعفونی كردن سطوح فلزی استفاده نكنيد. هيپوكلريت ها اثر خورندگی روی فلزات دارند.

هيپوكلريت ها به فرمالدئيد ها گاز های بسيار سمی توليد ميكنند.استفاده تواما آب ژاول و جوهر نمك بسيار خطر ناك است.

اتانول 70 درصد باعث دهيدراتاسيون و فيكساسيون ويروس های پوشش دار می گردد اما روی ويروس های بدون پوشش تاثيری ندارد.

فلاسك ها ی كشت دستكش های آلوده را بايستی در پلاستيك مخصوص اتوكلاو نمود و سپس دور ريخت يا در كوره های مخصوص سوزاند.

 

 
مرکز تحقیقات فناوری سلول های بنیادی
دانشگاه علوم پزشكی شيراز
شيراز، خيابان خليلي ، برج پژوهشي محمد رسول الله
تلفكس: 07136281547
 پست الكترونيك: 
sctrc@sums.ac.ir